Как сделать праймер: Приготовление битумного праймера — инструкция от производителя

Как из битумной мастики сделать праймер

Главная » Полезные советы

Полезные советы

На чтение 2 мин

Битумная мастика – материал, широко используемых для гидроизоляции кровли, фундамента и перекрытий строения. Его можно разделить на два основных вида, отличаемых по методике приготовления – холоднойи горячей. Холодную мастику можно использовать сразу, а горячую необходимо подогреть и добиться нужной консистенции.

Нередко начинающие строители интересуются – в чем разница между битумной мастикой и праймером, ведь они изготовлены практически из одинаковых материалов?

Отличия мастики от праймера

Мастику чаще всего применяют для заделки внешних швов и трещин на кровельных покрытиях. Ее недостатком является то, что после обработки поверхности до полного ее высыхания должно пройти не менее 20 часов.

Праймер, используемых для тщательного грунтования поверхностей и последующего приклеивания слоев гидроизоляции, высыхает всего за 3 часа. При этом в учет берется одинаковая температура окружающей среды.

Еще одно отличие заключается в том, что расход праймера значительно меньше расхода мастики и экономия средств видна невооруженным глазом.

Приготовление битумного праймера своими руками

Проверенный способ приготовления подразумевает использование битума и солярки. Для обработки металлических поверхностей нужно использовать сочетание материалов 1:3. Если предстоит обрабатывать бетонные покрытия, нужно применять дозировку битума и солярки 1:2.

Состав приготавливается способом уваривания. В качестве источников огня можно использовать костер, паяльную или керосиновую лампу. После разогревания, битум нужно влить в солярку тонкой струей, периодически помешивая раствор.

Важно помнить, что нужно вливать разогретый битум в солярку и ни в коем случае не наоборот.

Второй способ также эффективен, однако он подразумевает продолжительные временные траты. Подготовленную емкость необходимо наполнить чистым бензином, уложить в него куски битума и оставить их до полного растворения.

В данном случае стоит учитывать, что пары бензина будут испаряться, а потому емкость с бензином нужно герметично закрыть. Время приготовления такого раствора колеблется в районе 5-7 дней.

Немаловажно, что приготовленный праймер со временем становится тягучим, а потому его рекомендуется замешивать непосредственно перед использованием. При применении стоит контролировать температуру состава – она не должна быть ниже 80 градусов. Если раствор стал твердеть, его необходимо разогреть и только после этого продолжить выполнение работ.

( Пока оценок нет )

Поделится с друзьями

Как и чем наносить битумный праймер: технология работы

Битумный праймер наносят на поверхность для лучшего сцепления с ней мастики или рулонных материалов на основе битума. С одной стороны он проникает в структуру основания, с другой — надежно склеивается или сплавляется с кровельным покрытием за счет однородности материалов. Поэтому в технологию устройства рулонных и мастичных кровель обязательно входит праймирование поверхности. О том, как это сделать и чем наносить битумный праймер — ниже.

Битумный праймер состоит нефтяных битумов, присадок и органических растворителей. Причем растворителей в составе много — до 70%. Это значит, что битумная грунтовка — очень горючее вещество. Поэтому технология нанесения праймера включает целый список правил безопасности, которые необходимо соблюдать в обязательном порядке:

  1. Возле битумного праймера не должно быть открытого огня и искр. В том числе нельзя курить.
  2. Нельзя нагревать битумный праймер до +40 °C и выше.
  3. Перед наплавлением рулонных материалов горелкой необходимо дождаться полного высыхания обрабатываемой поверхности.
  4. Перед тем как нанести битумный праймер, нужно убедиться, что его срок годности не истек.
    Просроченную грунтовку использовать запрещено.
  5. Для защиты глаз, органов дыхания и кожи от едких паров растворителя нужно использовать плотно прилегающие очки, респиратор, латексные или резиновые перчатки.

Битумный праймер можно использовать в помещении, только если оно хорошо вентилируется.

Есть два метода работы с битумным праймером: контактное нанесение и аэрозольное распыление.

Контактный метод используют чаще — он проще. Не нужны ни особые навыки, ни специальное оборудование, достаточно только кисти или валика. Но при этом обработка больших площадей занимает много времени.

Для контактного нанесения битумного праймера используют:

  1. Кисти-макловицы для обработки основной площади. Чем шире кисть, тем лучше. Макловицы с жесткой натуральной щетиной шириной 170-180 мм — оптимальный выбор для праймирования поверхности.
  2. Плоские кисти. Маховая кисть для праймера битумного не должна быть очень широкой — достаточно 100 мм. В углах и на швах праймер нужно буквально вбивать, чтобы он хорошо заполнил все неровности. Поэтому щетина у плоской кисти должна быть максимально жесткая, но натуральная.
  3. Валик. Он еще сильнее ускоряет работу с грунтовкой по сравнению с кистью-макловицей. Каким валиком лучше наносить битумный праймер? Широким — 250 мм и более — и из натуральной шерсти.

Натуральная щетина для кистей или шерсть для валика — не обязательное, но очень желательное условие. Натуральные волокна намного лучше «держат» битумную грунтовку, чем искусственные. Поэтому при нанесении праймер ложится ровным тонким слоем без наплывов.

Для распыления битумного праймера используют краскопульты. Они создают мелкодисперсную взвесь, которая ложится на основание ровным тонким слоем. Этот способ нанесения праймера подходит как для горизонтальных, так и для вертикальных поверхностей.

Но напыление — намного более опасный метод работы с битумным праймером, чем контактное нанесение.

Распыляя грунтовку, краскопульт создает чрезвычайно горючий аэрозоль, который может вспыхнуть от малейшей искры. Поэтому при нанесении битумного праймера распылением особенно важно соблюдать правила безопасности. При этом используют пневматический или ручной краскопульт, а не электрический или, тем более, аккумуляторный.

Чем лучше наносить праймер битумный в зависимости от задачи:

  1. Используйте кисть-макловицу, если на поверхности есть небольшие неровности: трещины, сколы, шероховатые участки.
  2. Валик идеален для праймирования гладких и полушершавых поверхностей.
  3. Краскопульт оптимален для обработки стен и горизонтальных поверхностей большой площади.

Плоская кисть нужна в любом случае. Ее используют для обработки углов, мест примыканий и труднодоступных участков.

Во время хранения битумный праймер может загустеть. Кроме того, есть концентрированные разновидности грунтовки. В любом случае, перед тем как наносить битумный праймер густой консистенции, его нужно разбавить.

Для этого можно использовать уайт-спирит, бензин, керосин, сольвент и другие нетоксичные органические растворители. Дизельным топливом разводить праймер нельзя — оно испортит материал.

Разводят битумную грунтовку так:

  1. Емкость с праймером нагревают как минимум до комнатной температуры, лучше до 30-35 °C.
  2. В нагретую емкость вливают растворитель, обязательно небольшими порциями.
  3. Каждую порцию растворителя вмешивают в битумный праймер с помощью электродрели с насадкой-миксером. Важно, чтобы содержимое емкости стало однородным.
  4. Пункты 2 и 3 повторяют до тех пор, пока не получится грунтовка нужной консистенции.

Если битумный праймер не концентрированный, а высох во время хранения, то разведение ухудшает его свойства. Особенно если изначально грунтовка была быстросохнущей.

Технология работы с битумным праймером включает два этапа:

  1. Подготовка основания под праймирование.
  2. Непосредственное нанесение грунтовки на поверхность.

Оба этапа несложные, но трудоемкие. Особенно если бетонное основание в плохом состоянии и требует реставрации.

Подготовка поверхности под нанесение битумного праймера

Так как правильно наносить битумный праймер только на ровную и чистую поверхность, основание под него нужно подготовить.

Сначала поверхность очищают от пыли, грязи, мусора, а также снега и льда, если работы выполняются зимой. На старых кровлях нужно снять кровельный пирог как минимум до цементно-песчаной стяжки. Далее основание осматривают на предмет рыхлых, поврежденных участков и удаляют отслаивающиеся куски.

Затем все повреждения на поверхности заделывают раствором или битумным герметиком. Необходимо избавится от трещин, раковин, углублений. Если повреждений слишком много поверх основания делают новую стяжку с разуклонкой.

Перед тем как наносить битумный праймер на бетон, ему нужно дать высохнуть и обеспылить. Для удаления цементного молочка и мелкой пыли нужно использовать специальные промышленные пылесосы. В крайнем случае, загрязнения смывают мойками высокого давления. Но это менее эффективный способ очистки.

Как наносить битумный праймер

Битумный праймер обычно можно наносить при температуре от -5 °C до +20 °C. Но есть и специализированные составы, у которых другой температурный режим. Поэтому перед использованием праймера всегда сверяйтесь с информацией на упаковке.

Если температура битумной грунтовки меньше +15 °C, ее нужно отогреть перед применением. Для этого емкость со смесью заносят в теплое помещение как минимум на сутки.

Ведро с битумным праймером открывают непосредственно перед нанесением. Иначе растворитель может частично испариться, а смесь — загустеть. Перед использованием состав перемешивают дрелью с насадкой-миксером до однородности. При необходимости грунтовку разбавляют.

Дальше технология нанесения праймера такая:

  1. Битумную грунтовку наносят только на сухое основание, влажность которого не должна превышать 15%.
  2. На ровное основание праймер лучше всего наносить параллельными полосами с помощью валика или кисти-макловицы.
    При этом по свежему праймеру нельзя ходить, поэтому перемещение рабочего нужно спланировать так, чтобы он всегда находился на непрокрашенном участке.
  3. В местах примыканий, стыков плит и деформационных швов праймер наносят плоской кистью, как бы вбивая состав в бетон и углы. При этом обязательно промазывают не только горизонтальные, но и вертикальные участки на высоту не менее 150 мм.
  4. При необходимости наносят второй слой праймера, но только после полного высыхания первого. Готовность грунтовки можно проверить с помощью белой тканевой салфетки или перчатки: ткань должна остаться чистой после соприкосновения с праймированной поверхностью.

Второй слой битумной грунтовки нужен не всегда. Для большинства задач достаточно одного слоя. Чтобы определить, сколько слоев праймера битумного необходимо наносить, ориентируйтесь на расход. В зависимости от типа поверхности он должен быть равен:

  • 0,25-0,3 л/м2 для бетона и цементно-песчаной стяжки;
  • 0,3-0,5 л/м2 для дерева.

Если после нанесения первого слоя расход получился меньше необходимого, необходим второй слой. Особенно тщательно контролировать расход нужно при использовании краскопульта. Он позволяет наносить битумный праймер очень тонким слоем.

С битумным праймером нельзя работать возле открытого огня и без средств защиты из-за растворителей в его составе. Наносят грунтовку кистями, валиком или с помощью краскопульта, причем инструмент выбирают в зависимости от задачи.

Так как наносится битумный праймер самым первым, в технологию работы с ним входит подготовка основания. Его нужно очистить от пыли и мусора, замазать повреждения, обеспылить. Сам праймер наносят на сухую поверхность параллельными мазками, как правило, в один слой. Второй слой нужен, если расход на первый оказался меньше нормативного.

Будьте в курсе!

Подпишитесь на новостную рассылку

Как создавать грунтовки | ZYMO RESEARCH

Советы и рекомендации по проведению чувствительных ПЦР-анализов

Дизайн праймеров является важным шагом в разработке хорошего эксперимента ПЦР в реальном времени. Есть много элементов, которые следует учитывать при разработке праймеров, которые могут помочь свести к минимуму устранение неполадок в будущем. Вот важные рекомендации по созданию специфических и эффективных праймеров для нескольких типов ПЦР-анализов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это биохимический процесс, в котором используются повторяющиеся циклы нагревания и охлаждения для амплификации интересующей генетической области, называемой ампликон. В каждом цикле двухцепочечная ДНК сначала денатурируется, а затем охлаждается, позволяя коротким олигонуклеотидным праймерам отжигаться с 3′-концом каждой цепи ДНК ампликона. Затем эти праймеры используются ДНК-полимеразой для построения новых комплементарных цепей, что приводит к удвоению числа молекул ДНК целевой последовательности ДНК для каждого цикла ПЦР. Хотя эта система невероятно полезна для амплификации и точного количественного определения интересующего гена, существует несколько препятствий, которые могут снизить эффективность праймеров и поставить под угрозу ваш эксперимент. Вот основные рекомендации по разработке праймеров для ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР), количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР), бисульфитной ПЦР и ПЦР, специфичной к метилированию (MSP).

Рисунок 1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) состоит из множества циклов нагревания и охлаждения, которые позволяют проводить денатурацию двухцепочечной ДНК, отжиг олигонуклеотидных праймеров и удлинение новых комплементарных цепей с помощью ДНК-полимеразы. Количество копий ампликона экспоненциально увеличивается с каждым циклом ПЦР.

Советы по дизайну грунтовки:

  • Поддерживайте температуры плавления (T m ) каждой пары грунтовок в пределах 2°C друг от друга. Т м можно приблизительно рассчитать по формуле Т m = (A+T) x 2 + (G+C) x 4, однако более точные и сложные инструменты расчета T m доступны онлайн. Наличие одинаковой T m между праймерами гарантирует, что прямой и обратный праймеры будут связаны с их комплементарными цепями ДНК одновременно, уменьшая вероятность того, что праймер с самой высокой T m свяжется с неспецифическими последовательностями ДНК.
  • Используйте температуру отжига (T a ) на 3-5°C ниже температуры плавления. Температура отжига — это температура, при которой праймеры будут связываться с новой цепью матрицы. Это значение должно быть ниже Т m , чтобы праймеры могли эффективно связываться с мишенью, но не слишком низким, чтобы праймеры связывались с неспецифическими мишенями.
  • Держите праймеры длиной от 18 до 22 пар оснований. Длина этого праймера достаточна для обеспечения специфичности связывания, а также достаточно коротка, чтобы удерживать T m в соответствующем диапазоне.
  • Дизайнерские грунтовки с содержанием GC 35-65%. Содержание GC от 35% до 65% без длинных участков (> 4 оснований) одного и того же нуклеотида обеспечит достаточную сложность последовательности для оптимальной специфичности праймера.
  • Минимизируйте количество повторов G/C, особенно на 3’-конце праймера. Цитозин и гуанин обладают большей аффинностью связывания, чем аденин и тимин, а повторы более 4 G или C могут связываться со многими участками генома с высокой аффинностью. Если эти повторы находятся на 3′-конце праймера, ДНК-полимераза может удлинять ампликоны в нецелевых местах, что в конечном итоге может снизить эффективность ПЦР.
  • Ограничение длины ампликона до 140 пар оснований. Ампликоны длиной от 70 до 140 пар оснований, как правило, имеют достаточную длину, чтобы можно было разработать два эффективных праймера и зонд (если требуется анализ на основе TaqMan) для анализов количественной ПЦР. Возможны более длинные ампликоны, хотя может потребоваться корректировка протокола термоциклера, чтобы обеспечить полное удлинение новой нити. Кроме того, если образец содержит сильно фрагментированную ДНК, лучше использовать ампликоны меньшего размера, чтобы повысить вероятность наличия неповрежденных последовательностей-мишеней для связывания праймеров.

Наконечники для датчика TaqMan®:

  • Температура плавления зонда должна быть на 4–8°C выше, чем у грунтовки. Для анализов количественной ПЦР на основе TaqMan зонды предназначены для гибридизации с ДНК-мишенью до того, как праймеры начнут удлинять нити. Это позволит поддерживать максимально высокий уровень сигнала без ущерба для специфичности.
  • Держите длину зонда в пределах 20-25 пар оснований. Зонды, которые немного длиннее праймеров, будут оставаться связанными с мишенью на протяжении всей элонгации и, вероятно, будут более специфичными для целевого участка ДНК.
  • Не перекрывайте сайты связывания зонда и праймера. Зонды и праймеры с перекрывающимися сайтами связывания нельзя использовать в одной и той же реакции.
  • Избегайте гуанина на 5’-конце зонда . Гуанин оказывает гасящее действие на флуорофоры, прикрепленные к зондам TaqMan, что может ослабить сигнал в вашей реакции.

Рекомендации по праймерам и зондам:

  • Не создавайте праймеры или зонды, содержащие общие SNP. Проверьте данные генома, чтобы убедиться, что сайты связывания праймеров и зондов не содержат обычных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). SNP могут мешать связыванию праймера или зонда, вводя вариации последовательности в подмножество тестируемых образцов. Вы можете использовать инструмент Genome Browser UCSC для проверки SNP.
  • Проверьте олигонуклеотидные последовательности на наличие шпилек, собственных димеров и гетеродимеров. Избегайте использования олигонуклеотидов, которые сильно взаимодействуют сами с собой (шпильки или самодимеры) или с другими олигонуклеотидами в реакционной смеси (гетеродимеры), особенно если взаимодействие происходит на 3’-конце праймера.
  • Сравните последовательности олигонуклеотидов с геномом хозяина. Праймеры должны быть специфичны для интересующей последовательности-мишени. Чтобы обеспечить специфичность для правильного местоположения генома, вы можете использовать инструмент BLAST NCBI для перекрестной ссылки последовательности праймера на весь геном.

ДНК-полимераза ZymoTaq (каталожный номер E2001) позволяет легко проводить количественную ПЦР с горячим стартом, уменьшая при этом димеры праймеров и образование неспецифических продуктов. Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с нашей коллекцией продуктов ZymoTaq Polymerase.

Приведенные выше советы также применимы к несколько иной форме ПЦР, называемой количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). RT-qPCR позволяет выполнять ПЦР, начиная с РНК, а не с ДНК. РНК сначала преобразуют в кДНК (обратная транскрипция или ОТ), а затем амплифицируют с помощью ПЦР, как описано в предыдущем разделе. Во время созревания РНК подвергается сплайсингу, при котором интроны удаляются из последовательностей пре-мРНК. По этой причине последовательности мРНК отличаются от последовательностей геномной ДНК. Благодаря сплайсингу можно разработать анализ ПЦР, специфичный для транскрипта РНК.

  • Разработайте праймеры над экзон-экзонным соединением для количественного определения мРНК вместо гДНК. Если возможно, спроектируйте по крайней мере один праймер над экзон-экзонным соединением, чтобы повысить специфичность реакции для мРНК по сравнению с гДНК (это будет полезно в случае, если геномная ДНК не была полностью удалена из образца РНК). Большая часть 5′-конца последовательности праймеров должна располагаться на одном экзоне, оставляя только 3-4 основания на 3′-конце в следующем экзоне.

Zymo Research предлагает высококачественные реагенты для эффективного синтеза кДНК и надежной амплификации КПЦР, которые могут упростить и улучшить рабочий процесс ОТ-КПЦР. Используя набор ZymoScript RT PreMix Kit (каталожный № R3012), синтез полноразмерной кДНК с высоким выходом может быть достигнут менее чем за 15 минут. В качестве альтернативы быстрая обратная транскрипция и высокочувствительная амплификация количественной ПЦР могут быть выполнены в одной реакции с использованием набора ZymoScript One-Step RT-qPCR Kit (каталожный номер R3014). Набор ZymoScript One-Step RT-qPCR Kit совместим с анализами на основе зондов SYBR Green и TaqMan, что обеспечивает максимальную гибкость. В обоих наборах используется синий краситель для отслеживания, чтобы упростить настройку реакции и сэкономить время. Дизайн и настройка RT-qPCR никогда не были более удобными и мощными. Для получения дополнительной информации о новой линейке продуктов ZymoScript, пожалуйста, свяжитесь с нашими учеными по адресу [email protected] или позвоните по телефону (949) 679-1190 доб. 3.

Рисунок 2. RT-qPCR начинается со стадии обратной транскрипции, которая превращает мРНК в кДНК с использованием фермента обратной транскриптазы. После преобразования мРНК в кДНК реакция ПЦР продолжается циклами денатурации, отжига и удлинения для амплификации области-мишени. Рисунок 3. Обработка бисульфитом натрия превращает цитозин в урацил.

Бисульфитная ПЦР — это многоэтапный процесс, который позволяет пользователям определять статус метилирования сайтов CpG в ампликоне ПЦР. Первым этапом бисульфитной ПЦР является бисульфитная конверсия ДНК. Преобразование бисульфита — это процесс, в котором используется бисульфит натрия для преобразования всех неметилированных цитозинов в ДНК в урацил. Напротив, метилированные цитозины не изменяются при обработке бисульфитом натрия. После стадии бисульфитной конверсии проводят реакцию ПЦР для определения статуса метилирования сайтов CpG, расположенных между двумя праймерами. Во время этой ПЦР преобразованные урациловые основания считываются и амплифицируются как тимин, в то время как метилированные цитозины продолжают амплифицироваться как цитозин. Таким образом, цитозины, которые были метилированы в исходной ДНК, будут единственными цитозинами, оставшимися в последовательности ДНК после амплификации. Основываясь на этом принципе, можно путем секвенирования продукта ПЦР с бисульфитом определить статус метилирования цитозинов в исходном образце ДНК. Хотя этот метод полезен для изучения статуса метилирования ДНК, превращение неметилированных цитозинов в урацил приводит к потере комплементарности двух цепей ДНК и значительному снижению сложности последовательности ДНК. Это делает дизайн праймеров, специфичных для интересующей области ДНК, более сложной задачей.

Рисунок 4. Все неметилированные цитозины в последовательности ДНК превращаются в урацил во время бисульфитной конверсии, а затем амплифицируются в виде тимина во время бисульфитной ПЦР. Напротив, метилированные цитозины не затрагиваются процессом бисульфитной конверсии и продолжают амплифицироваться в виде цитозина во время бисульфитной ПЦР.

Наконечники для бисульфитной грунтовки дизайн:

  • Дизайнерские праймеры длиной от 26 до 30 пар оснований. Это повысит вероятность разработки конкретного праймера с адекватным T м .
  • Храните ампликоны между 70-300 парами оснований. Поскольку обработка бисульфитом приводит к фрагментации ДНК, амплификация длинных ампликонов является более сложной задачей, чем короткие ампликоны. Для достижения оптимальных результатов держите длину ампликона от 70 до 300 п.н.
  • Избегайте сайтов CpG в последовательностях праймеров. Если неизбежно включение сайта CpG в последовательность праймера, поместите его на 5’-конце праймера и добавьте вырожденное основание (Y), комплементарное положению цитозина в противоположной цепи.
  • Дайте реакции пройти от 35 до 40 циклов. Преобразование бисульфита — это жесткий процесс, который приводит к фрагментации и повреждению ДНК. Разработайте программы ПЦР по крайней мере с 35 термическими циклами, чтобы компенсировать фрагментацию ДНК.
  • Используйте полимеразу горячего старта для бисульфитной ПЦР для повышения специфичности. Неспецифическая амплификация относительно распространена в бисульфит-конвертированной ДНК из-за того, что она богата АТ. Использование полимеразы горячего старта и оптимизированного дизайна праймера и протокола поможет сократить количество неспецифических продуктов.
  • Поддерживайте температуру отжига в пределах 55-60°C для повышения специфичности.
    • Рис. 5. При разработке праймеров для бисульфитной ПЦР лучше избегать CpG-сайтов в последовательности праймеров, поскольку эти цитозины могут быть метилированы, а могут и не быть. Если в праймере нельзя избежать сайта CpG, поместите его на 5′-конце праймера и включите вырожденное основание (Y/R) вместо цитозина (для прямых праймеров) или комплементарное цитозину (для обратных). грунтовки).

    Подробнее о преобразовании бисульфита см. в нашем Руководстве по бисульфиту для начинающих. Для быстрой и полной бисульфитной конверсии ДНК и РНК для анализа метилирования см. наш ассортимент наборов для бисульфитной конверсии и коллекции полимераз ZymoTaq.

    Специфическая ПЦР для метилирования (MSP) основана на амплификации для оценки статуса метилирования в определенных сайтах CpG после бисульфитного превращения. Успех этой системы зависит от дифференциальной амплификации матрицы с использованием наборов метилированных (М) и неметилированных (U) праймеров. Хотя большинство соображений по дизайну праймеров MSP идентичны таковым для ПЦР с бисульфитом, сайты CpG в праймерах обрабатываются по-разному. Бисульфитная ПЦР исследует статус метилирования всех сайтов CpG, присутствующих в определенной области, в то время как MSP оценивает метилирование в одном сайте CpG, комплементарном 3′-концу последовательности праймера.

    • Создайте наборы праймеров M и U с сайтами CpG на 3’-конце. В зависимости от расположения CpG-сайтов на исходной смысловой или антисмысловой цепях ДНК два набора праймеров будут содержать разные основания в CpG-положении. Метилированные праймеры будут содержать либо C, либо G в положениях CpG, а неметилированные праймеры будут содержать либо T, либо A. Набор праймеров (M или U), который амплифицирует последовательность-мишень, будет информировать о статусе метилирования этого сайта CpG.

    Для получения дополнительной информации о MSP см. раздел MSP в нашем Руководстве по бисульфиту для начинающих.

    Рисунок 6. Блок-схема дизайна праймера для бисульфитной ПЦР и ПЦР, специфичной к метилированию (MSP). (A) После обработки бисульфитом две преобразованные цепи ДНК-матрицы больше не комплементарны. Важно отметить, что с любым данным набором праймеров будет амплифицироваться только одна цепь. Это иллюстрируется следующими примерами: (B) Праймеры для бисульфитной ПЦР предназначены для последующего секвенирования и анализа цитозинов в ампликоне. Сайтов CpG в праймерах следует избегать или располагать на 5′-конце со смешанным основанием в положении цитозина (Y=C/T, R=G/A). Данные секвенирования обычно представлены в виде графика «леденец», где темные кружки представляют метилированные положения цитозина, а открытые кружки — неметилированные. (C) Праймеры для ПЦР, специфичной для метилирования (MSP), предназначены для нацеливания и оценки статуса метилирования в определенных сайтах CpG. Сайты CpG в праймерах должны быть расположены на 3’-конце, чтобы повысить их специфичность к метилированным (М) или неметилированным (U) матрицам. Полностью метилированные или неметилированные матрицы будут генерировать один ампликон только из своего репрезентативного набора праймеров после MSP. Образцы со смешанным метилированием будут амплифицироваться обоими наборами праймеров.

      Темы

      COVID-19 ДНК Относящийся к окружающей среде Эпигенетика микробиомика НГС Плазмидная очистка РНК Сбор образцов Дрожжи

      */ .blog-zymo .learn-more__container { выравнивание текста: по центру; поле сверху: 70px; } .blogs-topic-tags__container { ширина: 60%; поле сверху: 70px; } .blogs-aside__heading { цвет: #69727б; } .blogs-aside__anchor { поле слева: 30px; нижняя граница: 20px; высота строки: 1; } .изображение-заголовок { положение: родственник; переполнение: скрыто; высота: 250 пикселей; } .image-заголовок: перед { содержание: ‘ ‘; дисплей: блок; положение: абсолютное; слева: 0; сверху: 0; ширина: 100%; высота: 250 пикселей; z-индекс: 1; непрозрачность: 0,7; фоновый повтор: без повтора; размер фона: обложка; -ms-background-size: обложка; -o-background-size: обложка; -moz-background-size: обложка; -webkit-background-size: обложка; } Только экран @media и (максимальная ширина: 414 пикселей) { . название статьи { отступ слева: 10px; отступ справа: 10px; размер шрифта: 25px; } .blog-zymo .subtitle { размер шрифта: 20px; } .blog-zymo .featured-image { нижняя граница: 50px; } .blog-zymo .block-quotes { отступ: 45px 20px; } }

      Проектирование праймера – Пошаговая демонстрация

      Оглавление

      Добавьте заголовок, чтобы начать создание оглавления

      Введение

      В этой статье показано, как создавать праймеры (прямые и обратные) для различных типов методов клонирования.

      Дизайн праймера продемонстрирован с использованием гена Dsup (Damage Suppressor) тихоходки (водяной медведь). Тихоходки — очаровательные животные с экстраординарными способностями справляться с экстремальными условиями, такими как космический вакуум, высокой устойчивостью к ультрафиолетовому излучению, устойчивостью к высоким и низким температурам. Белок Dsup — это недавно открытый ген, который придает устойчивость к ультрафиолетовому излучению, покрывая себя ДНК.

      Для амплификации любой последовательности ДНК необходимы два праймера. Один называется «прямой праймер», а другой — «обратный праймер». Прямой праймер синтезирует верхнюю цепь, используя нижнюю цепь в качестве матрицы. В то время как обратный праймер использует верхнюю цепь в качестве матрицы и синтезирует нижнюю цепь.

      Хотя названия предполагают, что они создают копии разных нитей, их названия зависят от направления нити, используемой для усиления.

      Прямой праймер создает копии 5’-3’-цепи, тогда как обратный праймер создает копии комплементарной (3’-5’) нити.

      В случае, если вы возьмете комплементарную последовательность и используете ее для конструирования праймера (располагая последовательность в 5’-3’), обратный праймер в приведенном выше примере теперь действует как прямой праймер.

      Следующие материалы посвящены демонстрации разработки праймеров для различных методов клонирования. Чтобы продолжить, откройте последовательность Dsup по этой ссылке.

      Мы используем бесплатное программное обеспечение APE (A Plasmid Editor) для разработки праймеров. Вы можете скачать копию по этой ссылке.

      Этапы проектирования праймера остаются прежними, даже если вы используете другой инструмент.

      Разработка прямого праймера

      Рис. 1. Последовательность, выбранная для создания прямого праймера (текст, выделенный синим цветом, указан стрелкой). Красное поле указывает параметры выбранной последовательности, такие как T m , длина последовательности и GC%.

      Ниже приведены этапы разработки переднего праймера:

      1. Мы скопировали Dsup нуклеотидной последовательности гена с портала NCBI (упомянутого выше) и вставили ее в инструмент APE. Он начинается со стартового кодона (ATG) и заканчивается стоп-кодоном (ТАА). Последовательность гена имеет направление от 5’ к 3’. Обратите внимание, что здесь представлена ​​только одна цепь ДНК. Некоторые инструменты, такие как snapgene, будут отображать обе нити.
      2. Прямой праймер разработан путем выбора нуклеотидной последовательности от ATG до таких параметров праймера, как содержание GC и Т м (температура плавления) соответствует расчетным параметрам грунтовки.

      Несколько параметров выбранной последовательности можно просмотреть в разделе заголовка инструментов (красное поле). Параметры обновляются в режиме реального времени, поэтому вы можете выбрать или отменить выбор нуклеотидов в соответствии с требуемыми критериями.

        Для большинства случаев предпочтительна T m находится в пределах 55-62°C, а содержание GC составляет 40-60%.

      1. В приведенном выше примере длина праймера составляет 20 нуклеотидов, T m составляет 56,8°C (~57°C), содержание GC составляет 50%. Таким образом, эта последовательность может работать как прямой праймер. Кроме того, последовательность заканчивается на «С», что выгодно, поскольку она меньше колеблется, пока полимераза работает над удлинением праймера.
      2. Поскольку последовательность имеет направление от 5’ к 3’, прямой праймер можно заказать напрямую. Таким образом, последовательность прямого праймера для заказа — «ATGGCATCCACACACCAATC».
      3. Обратите внимание, что мы не упоминаем, что это 5’-ATGGCATCCACACACCAATC-3’. Как правило, последовательности ДНК следует указывать с 5’-3’, а последовательности белков — с NC-конца.
      4. Приведенная ниже иллюстрация (рис. 2) дает хорошее представление о том, как устроен прямой праймер и как он используется в реакции ПЦР.

      Рис. 2.   Иллюстрация, изображающая дизайн прямого праймера и его участие в ПЦР. 2.1 Двойная спираль ДНК показана бирюзовым цветом. Последовательность, обведенная синим открытым прямоугольником, используется для обратного праймера. Синяя лента указывает на грунтовку. 2.2 Дуплекс ДНК раскручивается в реакции ПЦР. 2.3 Связывание праймера с комплементарной цепью. 2.4 Удлинение грунтовки для создания верхней пряди (5’-3’).

      Разработка обратной грунтовки

      Разработка обратной грунтовки — довольно сложный процесс. Отчасти проблема связана с тем, что таким образом мы передаем последовательности ДНК. Другая половина проблемы заключается в том, что мы должны работать с нитью-шаблоном, чтобы разработать праймер для другой нити.

      Какими бы ни были проблемы, с помощью таких инструментов, как APE, разработка обратного праймера выполняется одним нажатием кнопки. Выполните шаги, указанные ниже, чтобы получить обратную последовательность праймера.

      1. Обратный праймер был разработан с конца последовательности, которую мы добавили к АРЕ.

      2. Необходимо помнить об одном важном моменте: следует ли включать стоп-кодон в праймер или нет. Этот критерий зависит от последующего рабочего процесса. Например, если вы хотите добавить метку (флуоресцентный белок или короткий пептид и т. д.) к С-концу белка, вам необходимо удалить стоп-кодон из обратного праймера, чтобы метка могла слиться во время трансляции. Если вашей целью является субклонирование гена или экспрессия белка без меток на С-конце гена, вам придется включить стоп-кодон, чтобы предотвратить трансляционное слияние векторных последовательностей. В этой демонстрации мы включаем стоп-кодон.

      3. Как и в прямом праймере, последовательность выбиралась до тех пор, пока такие параметры, как содержание GC, и T m не соответствовали желаемым значениям. Рекомендуется сохранять параметры (T m и содержание GC) как можно более близкими для прямого и обратного праймера (рис. 3).

      Рисунок 3. Последовательность, выбранная для разработки прямого праймера (текст, выделенный синим цветом, указан стрелкой). Красное поле указывает параметры выбранной последовательности, такие как T м , длина последовательности и GC%.

      4. Поскольку последовательность матрицы имеет направление от 5’ к 3’, обратный праймер нельзя заказать напрямую. Его необходимо обратно дополнить.

      5. Для обратного дополнения скопируйте последовательность (ctrl+c или cmd+c) и вставьте последовательность (ctrl+v или cmd+v) в новом окне (рис. 4.1). В заголовке APE есть кнопка для обратного дополнения последовательности. Выберите последовательность праймеров (если она еще не выбрана) и нажмите кнопку (рис. 4.2).

      Рисунок 4. Изображение, показывающее этапы обратной комплементации в программном обеспечении APE. 4.1 Кнопка для создания нового файла/окна. 4.2 Кнопка для обратной комплектации.

      6. Перепроверьте, была ли последовательность обратно дополнена или нет.

      7. До обратной комплементации последовательность 5’-CTGGAGGACGGAAGAGGAAGTAA-3’, а после обратной комплементации 5’-TTACTTCCTCTTCCGTCCTCCAG-3’.

      8. Кроме того, вы можете обратно дополнить последовательность без копирования и вставки последовательности в новое окно. Но мы не рекомендуем это, так как это изменяет исходную последовательность в файле.

      Объяснение обратной комплементации

      Двухцепочечная ДНК проходит в направлении от 5’ к 3’ с комплементарной парой оснований A=T и G=C. Поскольку мы показали только одну цепь ДНК (5’-3’ цепь), из нее необходимо извлечь последовательность обратных праймеров. Как упоминалось ранее, представление последовательностей ДНК является общим понятием. Если вы предоставляете последовательность ДНК компании, синтезирующей праймеры, они всегда предполагают, что вы записали последовательность в направлении 5’-3’ и синтезируют в том же порядке. Если вы не выполняете обратную комплементацию выбранной последовательности (с верхней цепи / 5′-3′ цепи), вы получите еще один прямой праймер, который начинается с конца интересующего вас гена (рис. 5).

      Рисунок 5. Иллюстрация, показывающая важность обратной комплементарности. 5.1 Двойная спираль ДНК показана бирюзовым цветом. Последовательность, обведенная синим открытым прямоугольником, используется для обратного праймера. 5.2 Дуплекс ДНК раскручивается в реакции ПЦР. 5.3 Связывание праймера с комплементарной цепью и удлинение праймера. полимеризация приводит к синтезу верхней цепи (5’-3’). Это действие эквивалентно действию прямого праймера.

      Обратное дополнение состоит из двух шагов.

      1. Комплементарная последовательность — это последовательность противоположной нити, но направленная в том же направлении. Например, комплементарной последовательностью 5′-ATGC-3′ будет 5′-TACG-3′. Применение того же принципа к последовательности, выбранной для праймера, т.е. 5’-CTGGAGGACGGAAGAGGAAGTAA-3’, приводит к 5’-GACCTCCTGCCTTCTCCTTCATT-3’. Комплементарная последовательность не может связываться ни с одной из цепей из-за отсутствия направленности или комплементарности.
      2. Итак, второй шаг включает изменение направления комплементарной последовательности на противоположное. Изменение направления просто меняет 5′ на 3′ и наоборот. Это превращает 5′-TACG-3′ в 3′-TACG-5′. Как обсуждалось ранее, последовательности ДНК должны быть записаны в направлении 5′-3′ (как говорит Джон Вик «Правила!»). Таким образом, последовательность меняется с 5′-TACG-3′ на 5′-GCAT-3′. Использование того же принципа для нашей комплементарной последовательности праймера изменит последовательность с 5’-GACCTCCTGCCTTCTCCTTCATT-3’ на 5’-TTACTTCCTCTTCCGTCCTCCAG-3’.

      Тот же процесс представлен на иллюстрации ниже (рис. 6).

      Рисунок 6.   Иллюстрация, изображающая дизайн обратного праймера и его участие в ПЦР. 6.1 Двойная спираль ДНК показана бирюзовым цветом. Последовательность, обведенная синим открытым прямоугольником, используется для обратного праймера. Синяя лента указывает на последовательность праймеров, выбранную для дизайна обратного праймера. обратная комплементация содержит два шага (дополнение и изменение направления). 6.2 Дуплекс ДНК раскручивается в реакции ПЦР. Праймер связывается с верхней нитью (5′-3′). Направление полимеризации в стойке матрицы скорее вне последовательности, как это происходит без обратной комплементации. 6.3 Удлинение праймера с образованием нижней нити (3’-5’).

      Параметры проектирования грунтовки

      При разработке грунтовки необходимо следовать определенным правилам. Некоторые из них обсуждались ранее (T m и GC%). Посмотрим сейчас на остальных.

      • Длина праймера обычно составляет от 12 до 30 оснований. 30 оснований не является жестким правилом, но указывает на увеличение вероятности вторичных структур.
      • Прямой и обратный праймеры не должны иметь разницы T m более 5°С.
      • Если вам интересно, как рассчитать T м, вот формула: 2(A+T)+4(G+C) или 2(wA+xT)+ 4(yG+zC) (w,x , y и z — количество соответствующих нуклеотидных остатков в данной последовательности праймеров).
      • T m – температура, при которой половина ДНК является одноцепочечной. На Т м 55-62 капсюли подействуют лучше.
      • Содержание ГХ в грунтовке должно поддерживаться на уровне 40-60%. Содержание GC 40-60% обеспечивает стабильную ассоциацию праймеров для связывания их последовательностей-мишеней. Потому что GC имеет тройную водородную связь по сравнению с парами оснований AT, которые имеют две водородные связи.
      • Последняя последовательность праймера на 3’-конце должна заканчиваться на G или C, что известно как Хлопок ГК . Тройная водородная связь уменьшает колебания, что дает полимеразе больше шансов пойти на удлинение праймера.
      • Праймер не должен содержать более трех нуклеотидов G или C в последних 5 нуклеотидах (3′), поскольку он может неспецифически связываться где-то еще (спаривание G-C более стабильно, чем спаривание A-T).
      • Праймер не должен содержать повторяющихся последовательностей, так как они могут образовывать вторичные структуры, тем самым подавляя реакцию ПЦР.
      • Прямой и обратный праймеры не должны иметь комплементарных последовательностей. Это может привести к амплификации праймеров, что приводит к димеру праймеров. Димеры праймеров изолируют ресурсы, которые предположительно доступны для амплификации храмовой ДНК.
      • Для некоторых последовательностей (промоторы, последовательности 5′- и 3′-UTR) получение идеальных параметров праймера, таких как длина праймера, T m и содержание GC, затруднено, поскольку они представляют собой AT-богатые последовательности. В этой ситуации необходимо расставить приоритеты T m .

      Хотя мы упомянули идеальные условия для создания праймеров, не всегда возможно контролировать выбор последовательности (например, амплифицирующий ген из стартового кодона). В этих случаях необходимо изменить стратегию разработки праймеров или стратегию амплификации.

      Вышеупомянутый праймер для демонстрации дизайна работает для нескольких методов клонирования, таких как

      ТА клонирование

      Клонирование с тупым концом

      Клонирование ТОРО ТА

      Клонирование ТОРО с тупым концом

      лигирование/рекомбинация или определение направленности вставки.